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膳食中的大部分維生素B2是以黃素單核苷酸（FMN）和黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）輔酶形式和蛋白質結合存在。進入胃后，在的作用下，與蛋白質分離，在上轉變為游離型維生素B2后，在小腸上部被吸收。當攝入量較大時，肝腎常有較高的濃度，但身體貯存維生素B2的能力有限，超過腎閾即通過，以游離形式排出體外，因此每日身體組織的需要由飲食供給。

維生素B2的主要生理功用是作為輔酶促進代謝。核黃素和磷酸及一分子蛋白質結合成為黃素酶。這一類酶又叫脫氫酶，重要的是要非常介導的氫原子轉移對糖、脂和氨基酸的代謝都很重要。它是許多動物和微生物生長的因素。

維生素B2與特定的蛋白質結合生成黃酶。黃酶在物質代謝中起傳遞氫的作用，參與組織的呼吸過程。